ELISA實(shí)驗標本如何處理和收集？

能夠應用ELISA 實(shí)驗的樣本種類(lèi)很多，有血清，血漿，細胞裂解液，細胞培養上清，尿液，肺泡灌洗液，腦脊液，各種組織勻漿等，每種樣本采集和處理的方式都不相同。市場(chǎng)部通過(guò)文獻、試劑盒說(shuō)明書(shū)和網(wǎng)友的經(jīng)驗，整理出以下方法僅供參考。

一 血清

1 采血后室溫靜置20min或更長(cháng)時(shí)間至血清析出。

2 將采集的血液用離心機4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

大部分ELISA檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時(shí)會(huì )釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標記的 ELISA測定中，溶血標本可能會(huì )增加非特異性顯色。此外還應避免細菌污染，因為菌體中可能含有含有內源性HRP，也會(huì )產(chǎn)生假陽(yáng)性反應。血清標本宜在新鮮時(shí)檢測。如在冰箱中保存過(guò)久，在間接法ELISA中可使本底加深。

二 血漿

1 取血后加入抗凝劑（EDTA、草酸鈉、肝素、枸櫞酸鈉等），混合10-20分鐘后，30分鐘內于冰上分離血漿以減少血小板的污染（也可以直接用抗凝管采集）。

2 將采集血液用離心機4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

注意事項：制備血漿標本需借助于抗凝劑EDTA,抗凝不*的標本因纖維蛋白原干擾而造成假陽(yáng)性。請注意指標說(shuō)明書(shū)上對于抗凝血劑是否有特殊要求，建議使用EDTA。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等于血清。

三 尿液

1 采集尿液樣本500ul，加入無(wú)菌試管中。

2 用離心機4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的樣本小心收集上清，棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

四 細胞培養上清

1 用無(wú)菌試管收集細胞培養上清液。

2 用離心機4℃，2000rpm離心15min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。

3 取上清并分裝保存備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

保存時(shí)間

一般ELISA檢測樣本在2-8℃下，可放置保存24-48小時(shí)；-20℃下，可放置保存1個(gè)月；-70℃下，可放置保存6個(gè)月。

五  組織勻漿

1 采集組織，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)重，剔除附屬的結締組織，稱(chēng)取組織塊。

2 用移液管量取0.1M PBS或者用0.86％冷生理鹽水，勻漿介質(zhì)或生理鹽水的體積總量應該是組織塊重量的9倍，用眼科小剪盡快剪碎組織塊（天熱時(shí)操作要在冰水浴中進(jìn)行，將盛有組織的小燒杯放入冰水中）。

3 勻漿的方式有多種：

a) 手工勻漿：將剪碎的組織倒入玻璃勻漿管中，再將剩余的1/3勻漿介質(zhì)或生理鹽水沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中進(jìn)行勻漿，左手持勻漿管將下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手將搗桿垂直插入套管中，上下轉動(dòng)研磨數十次（6～8分鐘），充分研碎，使組織勻漿化。

b) 機器勻漿：用組織搗碎機10000～15000r/min上下研磨制成10％組織勻漿，也可用內切式組織勻漿機制備（勻漿時(shí)間10秒/次，間隙30秒，連續3～5次，在冰水中進(jìn)行），皮膚、肌肉組織等可延長(cháng)勻漿時(shí)間。

c) 超聲粉碎：用超聲粉碎機進(jìn)行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用40安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。

4 將制備好的10％勻漿用離心機4℃，3000rpm離心15min，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。

5 取上清并分裝保存備用，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

六  細胞裂解液

1 取細胞培養板或細胞懸液，用PBS（PH7.2-7.4）洗滌細胞培養板1-2次。

2 通過(guò)反復凍融或加入組織蛋白萃取試劑（裂解液），使細胞破壞并放出細胞內成份。

3 用離心機4℃，2000rpm離心20min左右，將離心好的勻漿小心收集上清，棄下面沉淀。